離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)表面凈電荷的不同進(jìn)行分離的強(qiáng)有力工具。固定相是帶有電荷的基團(tuán)：陰離子交換劑帶正電（如DEAE, Q），結(jié)合帶負(fù)電的蛋白質(zhì)；陽(yáng)離子交換劑帶負(fù)電（如CM, SP），結(jié)合帶正電的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在偏離其等電點(diǎn)（pI）的pH條件下會(huì)帶上凈電荷。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣品上樣到低鹽濃度的緩沖液中時(shí)，帶相反電荷的蛋白質(zhì)會(huì)與樹(shù)脂結(jié)合，而帶相同電荷或電荷很弱的蛋白質(zhì)則直接流穿。然后，通過(guò)逐步或連續(xù)地增加流動(dòng)相中的鹽濃度（通常使用NaCl梯度），鹽離子與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合樹(shù)脂上的帶電位點(diǎn)，結(jié)合力較弱的蛋白質(zhì)先被洗脫，結(jié)合力強(qiáng)的后被洗脫。IEX分辨率高，載量大，是中間純化步驟的常用選擇。蛋白分離純化是一項(xiàng)復(fù)雜但非常重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。江夏區(qū)重組蛋白分離純化技術(shù)

固定化金屬離子親和層析是重組蛋白純化中較廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一。其原理是將螯合劑固定于介質(zhì)上，螯合鎳離子、鈷離子等過(guò)渡金屬離子，這些金屬離子又能與重組蛋白末端融合的寡聚組氨酸標(biāo)簽（如6xHis標(biāo)簽）特異性結(jié)合。結(jié)合后，通過(guò)提高咪唑濃度（咪唑競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合金屬離子位點(diǎn)）或降低pH進(jìn)行洗脫。IMAC具有結(jié)合容量高、通用性強(qiáng)、條件溫和易于保持蛋白活性等優(yōu)點(diǎn)，使其成為重組蛋白表達(dá)和純化標(biāo)準(zhǔn)化流程的關(guān)鍵。離子交換層析依據(jù)蛋白質(zhì)表面凈電荷的差異進(jìn)行分離。介質(zhì)表面帶有固定的離子基團(tuán)（如陰離子交換劑的季銨基，陽(yáng)離子交換劑的磺酸基），與帶相反電荷的蛋白質(zhì)分子發(fā)生靜電吸附。通過(guò)逐步增加緩沖液離子強(qiáng)度，帶電較弱的蛋白質(zhì)先被洗脫，帶電強(qiáng)的后洗脫。該方法分辨率高、載量大、成本相對(duì)較低，常作為親和層析后的中間純化步驟，有效去除電荷性質(zhì)不同的宿主細(xì)胞蛋白、核酸及聚集體等雜質(zhì)。安徽抗體純化蛋白分離純化中的污染問(wèn)題需要特別注意。

等電點(diǎn)沉淀是一種基于蛋白質(zhì)在pH等于其等電點(diǎn)時(shí)凈電荷為零、溶解度比較低的原理進(jìn)行的粗分離方法。通過(guò)調(diào)節(jié)樣品溶液的pH，可以使一類(lèi)等電點(diǎn)相近的蛋白質(zhì)或雜質(zhì)沉淀出來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)初步的富集或去除。該方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，常作為大規(guī)模純化中的初始步驟。共價(jià)層析是一種特殊的親和層析，其固定相上的基團(tuán)能與蛋白質(zhì)表面的特定官能團(tuán)形成可逆的共價(jià)鍵。例如，巰基丙基瓊脂糖凝膠可通過(guò)二硫鍵交換反應(yīng)，特異性結(jié)合含有游離半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)，隨后用含巰基還原劑（如L-半胱氨酸）的緩沖液進(jìn)行洗脫。該方法可用于純化特定的酶或抗體片段。

親和層析是所有層析方法中通常能提供比較高純度和富集倍數(shù)的一步。其原理是利用目標(biāo)蛋白與固定相上配體之間高度特異性的、可逆的生物化學(xué)相互作用。較經(jīng)典的例子是固定化金屬離子親和層析（IMAC），用于純化帶有組氨酸標(biāo)簽（His-tag）的重組蛋白，其與柱上的鎳離子或鈷離子結(jié)合。另一個(gè)廣泛應(yīng)用的是蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G親和層析，用于純化抗體，它們能特異性地結(jié)合抗體的Fc區(qū)域。此外，還有利用酶與底物/抑制劑、受體與配體、或標(biāo)簽與抗體（如FLAG-tag）的相互作用。親和層析通常作為第一步層析，能夠從復(fù)雜混合物中“一把抓住”目標(biāo)蛋白，即使其含量很低，也能在一步之內(nèi)實(shí)現(xiàn)數(shù)千倍的純化，極大地簡(jiǎn)化了后續(xù)步驟。不同分子量的蛋白質(zhì)可通過(guò)濾膜分離技術(shù)進(jìn)行純化。

層析樹(shù)脂是純化的主要材料，其性能直接影響分離效果和效率。選擇樹(shù)脂時(shí)需考慮多個(gè)因素：1）基質(zhì)材料，如瓊脂糖（高載量、親水、但流速較慢）、聚丙烯酰胺、葡聚糖或無(wú)機(jī)材料（如硅膠，耐壓高、流速快，但pH耐受范圍窄）；2）顆粒大小和分布，小顆粒分辨率高但反壓大，粒徑分布均一有助于獲得尖銳的洗脫峰；3）孔徑，必須足夠大以確保目標(biāo)蛋白能自由擴(kuò)散進(jìn)入顆粒內(nèi)部，充分利用其表面積；4）功能基團(tuán)，根據(jù)層析方法選擇（如Ni2? for IMAC, Protein A for 抗體，Q基團(tuán) for 陰離子交換）；5）載量、分辨率和回收率的平衡。此外，化學(xué)穩(wěn)定性、使用壽命和成本也是規(guī)模化生產(chǎn)中必須考慮的因素。通過(guò)優(yōu)化工藝參數(shù)，可顯著提高蛋白分離純化的成功率。洪山區(qū)酶蛋白分離純化基礎(chǔ)概念

常見(jiàn)的蛋白分離純化設(shè)備包括色譜儀和離心機(jī)。江夏區(qū)重組蛋白分離純化技術(shù)

蛋白質(zhì)聚集是純化過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題，表現(xiàn)為溶液渾濁或形成沉淀，導(dǎo)致活性喪失和產(chǎn)量下降。聚集可由多種應(yīng)力引發(fā)：暴露于氣-液界面（攪拌、起泡）、疏水表面吸附、反復(fù)凍融、過(guò)高濃度、偏離適pH或鹽濃度等。抑制策略包括：添加溫和去垢劑（如Tween-20， Triton X-100）以減少表面吸附和疏水相互作用；添加糖類(lèi)（蔗糖、海藻糖）或多元醇（山梨醇、甘油）作為穩(wěn)定劑；使用還原劑保持半胱氨酸處于還原狀態(tài)；優(yōu)化蛋白質(zhì)儲(chǔ)存濃度和緩沖液條件；以及避免機(jī)械應(yīng)力（如劇烈渦旋，改用溫和的移液）。江夏區(qū)重組蛋白分離純化技術(shù)

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