為了減少擴增突變的引入，推薦使用高保真PCRMix進行擴增，推薦使用預線性化的質粒作為模板，以減少環狀質粒模板殘留對克隆陽性率的影響。注意：以環狀質粒為模板時，PCR產物需要使用DpnI等甲基化敏感型限制性內切酶對擴增產物進行處理，或對產物進行膠回收純化。2.插入片段制備引物設計原則：通常使用PCR擴增的方法來獲得目的片段，PCR引物的5'端必須包含與其相鄰片段（插入片段或載體）末端同源的15~25nt（推薦18nt）序列,以保證擴增產物的5'端和3'端分別與相鄰片段形成重疊序列。目的片段PCR引物包括：載體與插入片段連接處引物、插入片段與片段連接處引物。插入片段正向擴增引物：5'—上游載體末端正向同源序列+酶切位點（可選）+基因特異性正向擴增序列—3’插入片段反向擴增引物：3‘—基因特異性反向擴增序列+酶切位點（可選）+下游載體末端反向同源序列—5’載體與插入片段、插入片段與片段連接處引物、載體反向擴增引物設計制作終序列圖譜引物設計工具1.在線設計更加專業，這款軟件用來繪制圖譜，編輯序列，設計引物，重組克隆都非常方便3.無縫克隆1、體系配制；a.適載體用量（ng）=×載體堿基對數，即pmol（單片段、多片段適用）；b.適片段用量。心血管功能評估系統，利用無創技術監測心臟結構與功能，評估心血管疾病風險與療愈效果。云南口碑好的科研技術服務

    一、實驗原理將Transwell小室放入配套培養板中，形成由細胞可穿透性膜分隔開的兩室系統，并將高營養液與低營養液分隔開，為進行侵襲實驗，在膜上室鋪基質膠（用由細胞外基質組成的凝膠堵塞膜中的孔，該凝膠旨在模擬細胞在體內侵襲過程中遇到的典型基質），通過將細胞放置在凝膠的一側，將趨化劑放置在凝膠的另一側，侵襲細胞將降解鄰近基質并遷移通過ECM凝膠（基質降解與定向運動相結合，即侵襲），從而通過計數穿過細胞以檢測細胞侵襲能力。由于Matrigel膠內含有層黏連蛋白、Ⅳ型膠原、纖連蛋白、硫酸肝素糖蛋白、觸角蛋白、TGF2β及生長因子等人體ECM的大多數成分，類似動物的基底膜。因此，可模擬真實的體內環境，體外檢測細胞的侵襲性，間接反映體內侵襲的能力。請注意，該結構不是纖維蛋白，而是更偏向凝膠樣二、實驗步驟1.實驗準備提前12h將Matrigel放到4℃融化，將實驗用到的頭、EP管等材料提前放到-20℃預冷；實驗前準備冰盒，整個實驗操作過程置于冰上進行；2.包被基底膜在冰上將Matrigel膠用無血清的細胞培養基進行稀釋，混勻后加入小室中，注意動作輕柔，不要產生氣泡，將小室放入CO2培養箱中孵育2h備用；3.水化基底膜將孵育完成的小室中上室多余的液體小心吸掉。青海整體科研技術服務平臺生物信息學教育與培訓，提升科研人員生物信息分析能力，促進學科交叉融合。

    6）加入適量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；（PBS溶液或培養基）（7）溶解后的病毒懸液分裝成小份，保存于-80℃，避免反復凍融。（凍融一次，滴度下降10%左右）4.滴度測定熒光計數法，耗時5天。（1）測定前一天，將HEK-293T細胞鋪板，96孔板，每孔加5×104個細胞，體積為100μL；（2）在EP管中做10倍梯度稀釋，連續10個稀釋度。稀釋方法如下：每種病毒準備10個EP管，每管加入900μl培養液，個管中加入100μl病毒原液，混勻后，吸取100μl加入第二個管混勻。依此類推，做十個稀釋度，每個稀釋度可做3個重復孔；（3）選取所需的細胞孔，吸去培養基。加入100μl稀釋好的病毒溶液。放入培養箱培養24h；（4）棄去帶病毒的培養液，每孔加不含雙抗的完全培養基；（5）48h后觀察熒光，應有初步表達；72h后觀察熒光，計算滴度。滴度等于帶有熒光的細胞數除以病毒原液量。比如在加入10-6μl病毒原液的孔中觀察到2個帶有熒光的細胞，就是2/（10-6）=2E+6，單位為TU/μl，也就等于2E+9TU/ml5.目的細胞（耗時3-4天）（1）細胞鋪板將狀態良好的目的細胞接種到6孔板，接種細胞數量因細胞的生長速度而略有不同，一般是保證第二天進行病毒的時候細胞匯合率介于50%至70%；。

    4%多聚甲醛固定液或冷**固定液(-20℃預冷20min)。d,封閉液。e,／LPBS緩沖液。2、染色方法a,取出培養有細胞的蓋玻片，用洗2-3遍。b,加入4%多聚甲醛試問固定30minc.加入的Tritonx-100,37℃,5min，PBS洗兩次，5min/次d.加入含、1%BSA的PBS中室溫封閉30min-1h。e.去封閉液，直接加入一抗，37℃孵育1h或4℃過夜。抗體以mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經試驗而定)。，10min/次g.加入FITC-二抗或TRITC-二抗，37℃，孵育1h。，10min/次，用濾紙吸干。(PBS配制)封片。j.免疫熒光顯微鏡下觀察，或于4℃避光保存。免疫熒光雙標記方法免疫熒光的雙標記是指同時標記細胞內兩種蛋白質分子，當懷疑某種配體與已知受體結合后可用此方法加以證明。此方法稍微復雜一些，應注意所用的一抗是來自不同種屬動物的兩種特異性抗體(例如：A抗體為多克隆抗體，來自家兔；B抗體為單克隆抗體，來自小鼠)。其次，兩種二抗所帶熒光素的發射光不應重疊，且盡量遠離，通常可以選擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等來組合。通常情況下，染色時兩種一抗可以同時孵育，然后可以同時孵育兩種二抗。但當染色結果一種顏色非常弱，而另一種顏色比較強時，應考慮先孵育顏色較弱的二抗。生物標志物發現服務，結合高通量篩選與驗證策略，識別血液中與疾病相關的蛋白質等，為早期診斷提供可能。

    蛋白抽提/WesternBlotting技術服務WesternBlotting技術服務(DH1004)一.服務內容1、蛋白提取：從人或動物細胞、組織，細胞等樣品中提取蛋白樣品。2、蛋白定量：對樣品中蛋白進行半定量分析。3、WesternBlot檢測（1）電泳：聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）分離蛋白樣品。（2）濕法轉印。（3）雜交：用抗體鑒定膜上的特定蛋白。（4）顯色：ECL熒光顯色，黑條帶白背景照片4、提供蛋白內參檢測（所有內參抗體均不收取費用）。5、預實驗及正式實驗服務。二.樣品要求1、細胞＞1×10^7；組織＞30mg；細菌濕重＞1mg等。2、樣品蛋白濃度＞1mg/ml，蛋白量＞200ug/樣品。3、建議提供目的蛋白陽性表達樣品（純蛋白、有陽性表達的細胞或組織、商品化的陽性對照產品等）作為陽性對照。注：若有特殊處理的樣品，請盡可能出示相關材料（具有保密性的材料除外）。三.收費標準服務項目免疫學檢測服務內容周期產物/報告價格（元）DH1004-01樣品準備總蛋白提取、定量、質控3天總蛋白質控報告100元/樣DH1004-02免疫印跡（WB）WB預實驗，質控WB體系5-10天完整實驗報告1000元/膜WB檢測正式實驗10-15天完整實驗報告1000元/膜四、客戶提供材料1、樣品：新鮮或正確保存的樣品以及與樣品相關的必要資料。基因組編輯技術如CRISPR-Cas9，精確修改基因序列，為研究基因功能、遺傳性疾病提供強大工具。云南口碑好的科研技術服務

微生物群落分析，運用16S rRNA測序技術，解析生物體內外微生物多樣性，探索微生物與宿主健康的關系。云南口碑好的科研技術服務

    具有高合成能力的DNA聚合酶可以耐受這些抑制劑，從而使直接PCR成為可能。具有高合成能力的聚合酶通常具有更高靈敏度，因此可從未純化樣本中擴增微量的DNA。8、重疊延伸PCR重疊延伸PCR技術(genesplicingbyoverlapextensionPCR，SOEPCR)，是采用具有互補末端的引物，使PCR產物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來的技術。這項技術目前主要有兩個應用方向：構建融合基因；基因定點突變。9、反向PCR反向PCR（InversePCR,IPCR）是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段，對某個已知DNA片段兩側的末知序列進行擴增。反向PCR設計之初是為了用于確定鄰近未知區域的序列，多用于研究基因的啟動子序列；致性染色體重排，如基因融合、易位和轉座；以及病毒基因整合，現在也常用于定點突變，復制一個具有預期突變的質粒。反向PCR流程，首先對模板進行限制性酶切消化和連接，選定的限制性內切酶不可剪切已知序列，從而使連接發生于側翼未知序列之間。使用低濃度的酶切DNA片段優化連接步驟，使其傾向于自我連接而非多片段連接（即形成連環體）。完成自我連接后，從DNA的已知區域啟動反向PCR。云南口碑好的科研技術服務