無縫克隆的原理：在載體末端和引物末端應(yīng)具有15-25個(gè)同源堿基（同源臂）。通過T5核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶，三種酶同時(shí)發(fā)揮功能，從而達(dá)到單片段或多片段與載體連接的技術(shù)。T5核酸外切酶：5‘→3’端消化DNA片段，形成粘性末端；DNA聚合酶：填補(bǔ)缺口；DNA連接酶：兩條DNA單鏈黏合起來。無縫克隆的特點(diǎn)傳統(tǒng)分子克隆無縫克隆傳統(tǒng)分子克隆和無縫克隆對(duì)比：?jiǎn)未尾迦肫危簜鹘y(tǒng)分子克隆一輪只能插入一個(gè)片段；無縫克隆單個(gè)至多個(gè)（≤5）。受限于酶切位點(diǎn)：傳統(tǒng)分子克隆是；無縫克隆不是。引入多余序列：傳統(tǒng)分子克隆是；無縫克隆不是。流程&操作時(shí)間：傳統(tǒng)分子克隆流程繁瑣，時(shí)間長。無縫克隆流程簡(jiǎn)單，時(shí)間短。克隆效率：傳統(tǒng)分子克隆較低；無縫克隆單片段≥95%。實(shí)驗(yàn)流程1.載體制備載體的線性化：酶切（單酶切、雙酶切）或反向PCR擴(kuò)增。①酶切制備使用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行載體線性化時(shí)，推薦使用雙酶切方法進(jìn)行，其次是單酶切。注意:1：經(jīng)雙酶切進(jìn)行線性化的載體無需去磷酸化，經(jīng)單酶切則需要去磷酸化；2：酶切完成后，應(yīng)將快速內(nèi)切酶失活或?qū)⒛康漠a(chǎn)物進(jìn)行純化后再用于重組反應(yīng)。②反向PCR擴(kuò)增制備載體末端引物設(shè)計(jì)：反向PCR擴(kuò)增制備線性化載體需要使用的引物。微生物藥物篩選平臺(tái)，針對(duì)耐藥菌開發(fā)新型抗生劑，應(yīng)對(duì)全球抗生劑危機(jī)。江蘇專業(yè)科研技術(shù)服務(wù)價(jià)格

    6）加入適量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；（PBS溶液或培養(yǎng)基）（7）溶解后的病毒懸液分裝成小份，保存于-80℃，避免反復(fù)凍融。（凍融一次，滴度下降10%左右）4.滴度測(cè)定熒光計(jì)數(shù)法，耗時(shí)5天。（1）測(cè)定前一天，將HEK-293T細(xì)胞鋪板，96孔板，每孔加5×104個(gè)細(xì)胞，體積為100μL；（2）在EP管中做10倍梯度稀釋，連續(xù)10個(gè)稀釋度。稀釋方法如下：每種病毒準(zhǔn)備10個(gè)EP管，每管加入900μl培養(yǎng)液，個(gè)管中加入100μl病毒原液，混勻后，吸取100μl加入第二個(gè)管混勻。依此類推，做十個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度可做3個(gè)重復(fù)孔；（3）選取所需的細(xì)胞孔，吸去培養(yǎng)基。加入100μl稀釋好的病毒溶液。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h；（4）棄去帶病毒的培養(yǎng)液，每孔加不含雙抗的完全培養(yǎng)基；（5）48h后觀察熒光，應(yīng)有初步表達(dá)；72h后觀察熒光，計(jì)算滴度。滴度等于帶有熒光的細(xì)胞數(shù)除以病毒原液量。比如在加入10-6μl病毒原液的孔中觀察到2個(gè)帶有熒光的細(xì)胞，就是2/（10-6）=2E+6，單位為TU/μl，也就等于2E+9TU/ml5.目的細(xì)胞（耗時(shí)3-4天）（1）細(xì)胞鋪板將狀態(tài)良好的目的細(xì)胞接種到6孔板，接種細(xì)胞數(shù)量因細(xì)胞的生長速度而略有不同，一般是保證第二天進(jìn)行病毒的時(shí)候細(xì)胞匯合率介于50%至70%；。云南提供科研技術(shù)服務(wù)公司轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究，橋接基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用，加速科研成果向臨床實(shí)踐的轉(zhuǎn)化。

    5）轉(zhuǎn)染6-8h后更換7ml不含雙抗的新鮮培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS）。（此時(shí)棄去的培養(yǎng)基中已含有少量的病毒，廢液以及所用的移液槍頭必須經(jīng)處理后才能丟棄）（6）換液后48h，用移液槍從培養(yǎng)皿的一側(cè)收集上清液到15mL離心管，3000r/min離心5min并用，過濾后的細(xì)胞上清液如果暫時(shí)不進(jìn)行進(jìn)一步處理，可分裝后置于-80℃冰箱保存。注意：通常細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后就可以看到熒光蛋白的表達(dá)，293T細(xì)胞會(huì)明顯的皺縮成圓形，48h可以進(jìn)行熒光照片的采集，判斷轉(zhuǎn)染效率。一般為了能獲得高滴度的病毒，需要通過不斷優(yōu)化條件，提高轉(zhuǎn)染效率。優(yōu)化條件包括：細(xì)胞培養(yǎng)條件，轉(zhuǎn)染試劑的優(yōu)化，三質(zhì)粒比例的優(yōu)化（1:1:1）等3.慢病毒的濃縮與純化（提高病毒滴度和純度）采用PEG8000方法濃縮病毒（1）5×PEG8000-NaCl配制：稱取NaClg;PEG800050g溶解在200mL純水中；121℃30min濕熱滅菌；保存在4℃；（2）每30ml過濾后的粗病毒液，加入5×PEG8000-NaCl母液mL；（3）每20～30min混合一次，共進(jìn)行3-5次，4℃放置過夜；（4）4℃，4000g，離心20min；（離心后可以直接看到病毒沉淀）（5）吸棄上清，靜置管子1～2min，吸走殘余液體；（吸走液體時(shí)要小心，不要吸走了沉淀）。

    原代細(xì)胞技術(shù)服務(wù)大類技術(shù)名稱價(jià)格細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)500元/周細(xì)胞復(fù)蘇、凍存187元/支細(xì)胞鑒定免疫熒光125元/樣，拍照，50元/組（基因、核）細(xì)胞流式檢測(cè)單標(biāo)62元/樣，雙標(biāo)100元/樣細(xì)胞藥理細(xì)胞毒理1125元/板(MTT、CCK8法)人源細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs3750元人臍動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞HUAECs3750元人臍靜脈血管平滑肌細(xì)胞HUVSMCs2500元人臍動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞HUASMCs2500元人臍間（華通膠）充質(zhì)干細(xì)胞HUSMC；4375元大鼠細(xì)胞大鼠心肌細(xì)胞SD-CMs3125元大鼠心肌成纖維細(xì)胞SD-CFs1875元大鼠心外膜細(xì)胞SD-ECs2500元大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞SD-VSMCs1875元大鼠主動(dòng)脈血管成纖維細(xì)胞SD-AVFs1875元大鼠頸動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞SD-CVSMCs2500元大鼠頸動(dòng)脈血管成纖維細(xì)胞SD-CVFs2500元大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞SD-PVSMCs2500元大鼠肺動(dòng)脈成纖維細(xì)胞SD-PVFs2250元大鼠肺細(xì)小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞SD-PASMCs3125元大鼠肺細(xì)小動(dòng)脈成纖維細(xì)胞SD-PAFs2500元大鼠肺成纖維細(xì)胞SD-PFs1875元大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞SD-AECsII3125元大鼠氣管平滑肌細(xì)胞SD-TSMCs1875元大鼠氣管上皮細(xì)胞SD-TECs3125元大鼠氣管成纖維細(xì)胞SD-TFs1875元大鼠支氣管上皮細(xì)胞SD-BECs2750元大鼠食道平滑肌細(xì)胞SD-ESMCs1875元大鼠食道成纖維細(xì)胞。干細(xì)胞庫建設(shè)與運(yùn)營，收集、儲(chǔ)存干細(xì)胞資源，為干細(xì)胞療愈及再生醫(yī)學(xué)提供穩(wěn)定供源。

    動(dòng)物模型技術(shù)服務(wù)大類技術(shù)名稱價(jià)格動(dòng)物培養(yǎng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購買：C57小鼠37元/只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購買：Balbc裸鼠137元/只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購買：Balbc裸鼠43元/只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)：大鼠4元/天/只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)：小鼠2元/天/只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模：大、小鼠見下冊(cè)心血管系統(tǒng)心梗模型625/562/只（大、小鼠）心肌肥厚模型625/562/只（大、小鼠）主動(dòng)脈損傷模型625/562/只（大、小鼠）主動(dòng)脈弓縮窄致心衰模型625/562/只（大、小鼠）頸動(dòng)脈球囊損傷模型625/562/只（大、小鼠）頸動(dòng)脈結(jié)扎致******模型625/562/只（大、小鼠）栓線法腦缺血MACO模型625/562/只（大、小鼠）膿毒血癥急性心肌損傷模型687/625元/只（大、小鼠）高脂飼料致高脂血癥模型750/687元/只（大、小鼠）神經(jīng)系統(tǒng)面癱模型750/687元/只（大、小鼠）視覺系統(tǒng)堿燒傷致角膜損傷模型375/312元/只（大、小鼠）成瘤系統(tǒng)裸鼠皮下成瘤模型500/只（Balbc/裸鼠）皮膚系統(tǒng)皮膚淺II°及深I(lǐng)I°燙傷模型375/312元/只（大、小鼠）肝膽系統(tǒng)膽管結(jié)扎模型500/437元/只（大、小鼠）黃疸模型500/437元/只（大、小鼠）肝膽性肝硬化模型500/437元/只（大、小鼠）酒精誘導(dǎo)肝硬化模型375/312元/只（大、小鼠）非酒精性脂肪肝模型562/500元/只。基因組編輯技術(shù)如CRISPR-Cas9，精確修改基因序列，為研究基因功能、遺傳性疾病提供強(qiáng)大工具。品質(zhì)好的科研技術(shù)服務(wù)平臺(tái)

生物藥物開發(fā)與優(yōu)化，涵蓋抗體藥物、疫苗等，通過高通量篩選、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等手段，提升藥物效力與安全性。江蘇專業(yè)科研技術(shù)服務(wù)價(jià)格

    蛋白抽提/WesternBlotting技術(shù)服務(wù)WesternBlotting技術(shù)服務(wù)(DH1004)一.服務(wù)內(nèi)容1、蛋白提取：從人或動(dòng)物細(xì)胞、組織，細(xì)胞等樣品中提取蛋白樣品。2、蛋白定量：對(duì)樣品中蛋白進(jìn)行半定量分析。3、WesternBlot檢測(cè)（1）電泳：聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）分離蛋白樣品。（2）濕法轉(zhuǎn)印。（3）雜交：用抗體鑒定膜上的特定蛋白。（4）顯色：ECL熒光顯色，黑條帶白背景照片4、提供蛋白內(nèi)參檢測(cè)（所有內(nèi)參抗體均不收取費(fèi)用）。5、預(yù)實(shí)驗(yàn)及正式實(shí)驗(yàn)服務(wù)。二.樣品要求1、細(xì)胞＞1×10^7；組織＞30mg；細(xì)菌濕重＞1mg等。2、樣品蛋白濃度＞1mg/ml，蛋白量＞200ug/樣品。3、建議提供目的蛋白陽性表達(dá)樣品（純蛋白、有陽性表達(dá)的細(xì)胞或組織、商品化的陽性對(duì)照產(chǎn)品等）作為陽性對(duì)照。注：若有特殊處理的樣品，請(qǐng)盡可能出示相關(guān)材料（具有保密性的材料除外）。三.收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)服務(wù)項(xiàng)目免疫學(xué)檢測(cè)服務(wù)內(nèi)容周期產(chǎn)物/報(bào)告價(jià)格（元）DH1004-01樣品準(zhǔn)備總蛋白提取、定量、質(zhì)控3天總蛋白質(zhì)控報(bào)告100元/樣DH1004-02免疫印跡（WB）WB預(yù)實(shí)驗(yàn)，質(zhì)控WB體系5-10天完整實(shí)驗(yàn)報(bào)告1000元/膜WB檢測(cè)正式實(shí)驗(yàn)10-15天完整實(shí)驗(yàn)報(bào)告1000元/膜四、客戶提供材料1、樣品：新鮮或正確保存的樣品以及與樣品相關(guān)的必要資料。江蘇專業(yè)科研技術(shù)服務(wù)價(jià)格