即為本發明構建的一種pirb基因敲入的小鼠動物模型。本發明所采用第二種技術方案的特點還在于，步驟1中得到grna1和grna2后分別與trancrrna在25℃孵育10min形成二級結構。步驟3中grna1、grna2的濃度均為2～10pmol/ul，cas9蛋白的注射濃度為30～100ng/μl。步驟4中southern雜交采用bamhi和avrii核酸內切酶切割f1代雜合子小鼠的dna。本發明的有益效果是：本發明提供了pirb基因敲入的小鼠動物模型及其構建方法，本發明的小鼠動物模型對于pirb基因功能的研究和在體驗證提供了良好的基礎。分離自pirb基因敲入小鼠的細胞還可以用于研究pirb發揮調節作用的下游機制。可以克服人類某些疾病潛伏期長，病程長和發病率低的缺點。南京哪家公司提供疾病動物模型建模

通過pirb敲入動物模型與不同類型cre小鼠的雜交，可以用于研究ad不同***或不同細胞類型pirb的調節作用。附圖說明圖1為本發明pirb基因敲入的小鼠插入pirb基因cds和loxp位點的打靶質粒載體的構建圖；圖2為本發明pirb基因敲入的小鼠模型的構建方法的流程圖；圖3為本發明f1代pirb敲入的小鼠的基因型pcr結果鑒定電泳圖；圖4為本發明f1代pirb敲入的小鼠驗證pirb基因敲入效果的測序峰圖；圖5為本發明f1代pirb基因敲入的小鼠進行southern鑒定的方法示意圖；圖6為本發明f1代pirb基因敲入的小鼠進行southern鑒定的結果圖。常州哪一家疾病動物模型建模小鼠疾病模型研究也是人相關疾病藥物研發的起點。

該模型能夠幫助我們研究pirb基因在免疫系統和神經系統的功能以及下游的調節機制。本發明的另一目的在于提供上述小鼠動物模型的構建方法。本發明所采用的第一種技術方案是：pirb基因敲入的小鼠動物模型，包括確定pirb基因的待敲入的特異性靶位點grna1和grna2，將pirb基因敲入c57bl/6j小鼠的rosa26基因的內含子1內，所述grna1的基因序列如seqid**所示，grna2的基因序列如。本發明所采用的第二種技術方案為：pirb基因敲入的小鼠動物模型的構建方法，具體按照以下步驟實施：步驟1、基于crispr/cas9技術構建針對c57bl/6j小鼠rosa26基因的特異性grna1和grna2，grna1的基因序列如seqid**所示，grna2的基因序列如；步驟2、構建“cagpromoter-loxp-stop-loxp-kozak-mousepirbcds-polya”基因盒打靶載體，將打靶載體進行線性化處理；步驟3、步驟2中將含有loxp位點打靶載體、步驟1中有活性的grna1和grna2與cas9蛋白共同注射進入**小鼠受精卵中，獲得f0代小鼠；步驟4、將步驟3中性成熟的陽性f0小鼠分別與野生型鼠交配繁一代，獲得f1代雜合子小鼠，通過pcr、測序和southern雜交確定動物基因型；步驟5、將步驟4獲得的f1代雜合子小鼠近交獲得f2代純合子小鼠。

無縫克隆的原理：在載體末端和引物末端應具有15-25個同源堿基（同源臂）。通過T5核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶，三種酶同時發揮功能，從而達到單片段或多片段與載體連接的技術。T5核酸外切酶：5‘→3’端消化DNA片段，形成粘性末端；DNA聚合酶：填補缺口；DNA連接酶：兩條DNA單鏈黏合起來。無縫克隆的特點傳統分子克隆無縫克隆傳統分子克隆和無縫克隆對比：單次插入片段：傳統分子克隆一輪只能插入一個片段；無縫克隆單個至多個（≤5）。受限于酶切位點：傳統分子克隆是；無縫克隆不是。引入多余序列：傳統分子克隆是；無縫克隆不是。流程&操作時間：傳統分子克隆流程繁瑣，時間長。無縫克隆流程簡單，時間短。克隆效率：傳統分子克隆較低；無縫克隆單片段≥95%。實驗流程1.載體制備載體的線性化：酶切（單酶切、雙酶切）或反向PCR擴增。①酶切制備使用限制性內切酶進行載體線性化時，推薦使用雙酶切方法進行，其次是單酶切。注意:1：經雙酶切進行線性化的載體無需去磷酸化，經單酶切則需要去磷酸化；2：酶切完成后，應將快速內切酶失活或將目的產物進行純化后再用于重組反應。②反向PCR擴增制備載體末端引物設計：反向PCR擴增制備線性化載體需要使用的引物。歡迎致電咨詢疾病動物模型建模。

實驗第21天起將小鼠置于霧化激發器內，給予2%OVA生理鹽水霧化激發，1次/d，每次30min，連續7天，將小鼠呼吸急促，搔鼻抓癢、嗆咳煩躁、點頭運動等作為小鼠模型成功的標準。正常對照組以生理鹽水代替OVA腹腔注射和霧化激發，操作同上所述。6.2模型鑒定及后續檢測：6.2.1小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)TH2型細胞因子蛋白水平檢測待造模完成后，抽取BALF后用ELISA方法檢測其中TSLP、IL-33和MUC5AC的表達情況。附支氣管肺泡灌洗液抽取方法：小鼠取血后，開胸，分離縱膈，注射器抽取3ml生理鹽水從氣管插管推入肺中，每次反復灌洗3次后抽出灌洗液，肺泡灌洗液以4℃3000r/min離心15min，取上清。結果顯示：模型小鼠與對照組小鼠相比，炎性因子及趨化因子水平均有性升高。動物模型的意義和優越性！南京哪家公司提供疾病動物模型建模

什么是疾病動物模型建模？南京哪家公司提供疾病動物模型建模

實驗期間每天進行陰道涂片，觀測動情周期變化。進一步地，檢測水平是指：檢測雌(e2)、促卵泡生長素(fsh)和促黃體生成素(lh)的水平。進一步地，檢測對比卵巢重量是指：比較各組大鼠雙側卵巢臟器系數。進一步地，陰道涂片是指：采用陰道脫落細胞涂片法，使用染色劑為亞甲基藍。本發明利用順鉑成功地建立了大鼠卵巢早衰模型，為基礎研究建立穩定的卵巢早衰動物模型奠定了良好的基礎。本發明使用的各種術語和短語具有本領域技術人員公知的一般含義。提及的術語和短語如有與公知含義不一致的，以本發明所表述的含義為準。附圖說明圖1：e2水平檢測結果示意圖。圖2：fsh水平檢測結果示意圖。圖3：lh水平檢測結果示意圖。圖4：大鼠體重檢測結果示意圖。圖5：大鼠卵巢重量統計示意圖。南京哪家公司提供疾病動物模型建模